10.扩增产物的单链不能形成二级结构 。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响 , 选择扩增片段时最好避开二级结构区域 。用有关软件(比如RNAstructure)可以预测估计mRNA的稳定二级结构 , 有助于选择模板 。实验表明 , 待扩区域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol时 , 扩增往往不能成功 。若不能避开这一区域时 , 用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的 。
11.引物应具有特异性 。引物设计完成以后 , 应对其进行BLAST检测 。如果与其它基因不具有互补性 , 就可以进行下一步的实验了 。
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